Хм

Jul 29, 2023

Научные отчеты, том 12, Номер статьи: 11432 (2022) Цитировать эту статью

900 Доступов

3 цитаты

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Наше предыдущее исследование продемонстрировало, что hsa-miR-143-3p является одной из высокоэкспрессируемых микроРНК в обогащенных эпителиальных стволовых клетках роговицы (CESC). Следовательно, данное исследование направлено на выяснение регуляторной роли hsa-miR-143-3p в поддержании стволовости CESC. Гены-мишени hsa-miR-143-3p были предсказаны и подвергнуты анализу путей для выбора мишеней для функциональных исследований. Первичные культивированные лимбальные эпителиальные клетки трансфицировали имитатором, ингибитором или скремблированной последовательностью hsa-miR-143-3p с использованием липофектамина 3000. Трансфицированные клетки анализировали на (i) колониеобразующий потенциал, (ii) экспрессию маркеров стволовых клеток (SC). факторы транскрипции (ABCG2, NANOG, OCT4, KLF4, ΔNp63), (iii) маркер дифференциации (Cx43), (iv) предсказали пять мишеней hsa-miR-143-3p (DVL3, MAPK1, MAPK14, KRAS и KAT6A), ( v) Регуляторы передачи сигнала MAPK и (vi) регуляторы передачи сигнала Wnt-β-катенина с помощью кПЦР, иммунофлуоресцентного окрашивания и/или вестерн-блоттинга. Высокая экспрессия hsa-miR-143-3p повышала колониеобразующий потенциал (10,04 ± 1,35%, p < 0,001) со способностью образовывать голоклоноподобные колонии по сравнению с контролем (3,33 ± 0,71%). В клетках, обработанных мимиком, наблюдалась повышенная экспрессия маркеров SC, но сниженная экспрессия мишеней Cx43 и hsa-miR-143-3p, участвующих в сигнальных путях Wnt-β-катенина и MAPK. Экспрессия β-катенина, активного β-катенина и ERK2 в клетках, трансфицированных ингибитором hsa-miR-143-3p, была выше, чем в контрольных клетках, а локализованная ядерная экспрессия указывала на активацию передачи сигналов Wnt и MAPK. Таким образом, была указана вероятная связь hsa-miR-143-3p с поддержанием CESC посредством ингибирования сигнальных путей Wnt и MAPK.

Роговица и слезная пленка составляют переднее прозрачное окно глаза, которое действует как физический барьер между оптической и внешней средой. Эпителий роговицы представляет собой самый внешний слой роговицы и регенерируется из эпителиальных стволовых клеток роговицы (CESC), которые присутствуют в базальном слое лимбального эпителия1. Эти резидентные стволовые клетки взрослых тканей составляют 3–5% всего лимбального эпителия и обычно находятся в состоянии покоя. Однако основной функцией CESC является управление такими процессами, как заживление ран2 и гомеостаз3, для поддержания прозрачности роговицы4. Молекулярный механизм поддержания стволовости CESC до сих пор не ясен, включая эпигенетическую регуляцию с помощью микроРНК (миРНК).

МикроРНК представляют собой некодирующие одноцепочечные РНК (от 18 до 24 нуклеотидов), которые регулируют уровень белка целевой информационной РНК (мРНК) без какой-либо модификации последовательности генов5. Известно, что микроРНК активно участвуют в различных клеточных процессах, таких как пролиферация, дифференцировка, клеточный метаболизм, гомеостаз и апоптоз6,7.

В нашем предыдущем исследовании CESC были обогащены до 80% с использованием двухэтапного протокола8 и сравнены с дифференцированными центральными эпителиальными клетками роговицы с помощью секвенирования малой РНК. Было идентифицировано шесть микроРНК - hsa-miR-3168, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-10a-5p и hsa-miR-1910-5p. быть высоко выраженным в обогащенных CESC и подтверждено с помощью qPCR. Интересно, что на основании гибридизации in-situ с заблокированной нуклеиновой кислотой было обнаружено, что hsa-miR-143-3p экспрессируется в базальном слое лимбального эпителия исключительно в кластерах небольших клеток, что указывает на его потенциальную ассоциацию с CESCs9. Кроме того, в этом исследовании оценивалась функциональная роль hsa-miR-143-3p в CESC.

В эмбриональных стволовых клетках мыши hsa-miR-143-3p способствовал самообновлению и повышал экспрессию генов плюрипотентности, таких как OCT4, KLF4 и ESRRB10. Также известно, что Hsa-миР-143-3p регулирует различные клеточные процессы, такие как дифференцировка11, пролиферация12,13, миграция14, апоптоз15,16 и регуляция клеточного цикла17.